하....Cloning..클로닝...

실험하는데 있어서 원하는 gene을 과발현 시켜서 해당 상황에서의 반응을 보는 것이 필요할 때가 있다. 이때 해당 gene을 과발현 시키기 위해서는 transfection이라는 과정을 주로 사용한다(바이러스를 사용하면 transduction이라고 함). Transfection을 할 때는 liposome을 형성하여 세포에게 전달하는 방법(lipofection) 전기적 자극(electroporation)을 통해 전달하게 된다. 일반적으로 가성비가 좋은 liposome 형성 기전을 채택하는데, 이 방법들 외에도 다른 다양한 방법들이 있다.

 

해당 liposome에는 plasmid라는 유전 물질이 들어가고 해당 plasmid에는 우리가 원하는 유전자를 넣어 준다. 이때 우리가 원하는 유전자 서열을 vector에 넣어주는 과정을 cloning이라고 한다.

 

1, 원하는 유전자 따기

1) cDNA 혹은 gDNA에서 insert따오기

① 처음부터 cloning을 하기위한 end들을 포함하여 PCR을 진행해도 괜찮으나 만약 잡band가 많고 또 yield가 낮다면 CDS 혹은 원하는 서열부분만 먼저 PCR로 따준다. 원하는 서열만 먼저 따로 나중에 cloning 용 END를 붙이는 것이 나을 것이다. 이때도 gel extraction 과정을 거쳐서 추출한 후 single band만 따주는 것이 중요하다.

② Gel extraction을 통해서 추출한 후, 해당 DNA를 다시 또 PCR을 통해 cloning 용 end를 달아준다(PCR 한 거에서 single band를 따서 또 PCR을 하는 것을 nested PCR 이라고 한다). 이때 cloning 용 end는 본인이 어떤 전략으로 cloning 하는지에 따라 달라진다.

ㄱ. restriction enzyme 이용 시: 해당 enzyme을 활용할 수 있는 end를 달아 줘야함. 각 enzyme들마다 인식하는 서열들이 있으니 해당 서열들을 넣어 줘야 한다.

ㄴ. fusion 사용시: TAKARA의 In-Fusion 제품, enzynomics의 EZ-fusion을 사용하게 되면 insert와 vector간 공통 서열들이 15-20mer 정도가 필요하다. 이러한 서열을 insert에 넣어주는 것이다.

2) 기존 Plasmid에서 insert 따오기

기존에 이미 내가 원하는 insert를 갖고 있는 plasmid가 있으면 cloning 난이도가 확 내려간다. 이럴 경우에는 insert 따는 과정이 훨씬 수월하여 성공 확률이 증가한다.

① plasmid에서 PCR을 통해 원하는 insert 서열을 따온다.

ㄱ. 이때도 마찬가지로, insert만 먼저 따고 나중에 cloning용 end를 달아줄 수도 있으나, 웬만해서는 바로 target gene에 대한 band가 진하게 검출되기에 cloning 용 end를 바로 달아주어도 무방하다.

ㄴ. 혹 운이 좋다면 내가 넣으려고 하는 vector system에 있는 restriction enzyme site들 중 사용 가능한 것들이 있다면 그냥 enzyme restriction을 통해 insert를 잘라낼 수도 있다.

 

이러한 과정들을 통해서 insert를 성공적으로 뽑아내었다면 이제 vector에 넣어주면 된다. 이때 앞서 말한 enzyme restriction 과정을 거쳐 ligation을 할 것인지, 아니면 Fusion 과정을 통해 ligation을 할 것인지가 달라진다.

 

2. 원하는 유전자를 plasmid에 넣어 주기

1) enzyme restriction 활용하기

 

자르고 붙이기: vector와 insert 모두에게 enzyme restriction을 진행하게 된다. 이때 sticky end 혹은 blunt end 형태가 되는데, sticky end의 경우 서로 상보적인 결합을 할 수 있는 형태가 되어 서로 맞물리게 된다. 따라서 ligase가 이를 인지하고 연결시켜 준다. Blunt end의 경우도 마찬가지이다. Blunt한 곳을 ligase가 인지하고 insert와 vector를 잡아서 연결시켜준다. 하지만 만약 양 끝단이 모두 blunt인 경우에는 문제가 생기는데, 뒤집혀서 들어갈 수도 있다는 것이다. 즉, 테트리스처럼 딱 맞물리는 것이 없다면 어느 방향이든 붙을 수 있기 때문에, colony가 자라더라도 sequencing으로 확인해보면 뒤집혀 있는 경우가 있다. 이러한 현상은 같은 restriction enzyme을 사용하는 경우에도 마찬가지로 일어날 수 있다. 그러므로 서로 다른 restriction enzyme을 사용하는 것이 좋다.

일반적으로 사용하는 ligase는 T4 ligase로 이는 blunt와 sticky 둘 다 인지한다. 즉, 만능으로 활용할 수 있는 것으로 양 끝단을 이어주게 되고 이를 통해서 다시 plasmid vector 형태로 만들어주게 된다.

서로 다른 sticky end를 사용하는 방법

sticky end와 blunt end를 이용한 clonging의 예

blunt end만 사용한 아주 잘못된 cloning의 예시....

같은 sticky end만 사용하는 아주 옳지 않은 cloning 예시

 

 

2) fusion 활용하기: 겹치는 서열 인식 후 자르기 및 붙이기

 

Vector와 insert에 둘 다 공통된 서열을 PCR을 통해서 넣어준다. 물론, 어느 정도의 enzyme cut이 있어도 상관이 없다고 하지만 깔끔하게 양 끝단에 공통된 서열을 최소 15mer-20mer정도 넣어주는 것이 좋다. 그래야 성공확률이 올라간다. 그리고 PCR 진행 시 사용하는 PRIMER가 시작하는 부분을 G 또는 C로 하여 주는 것이 좋고, GC contents를 40-60%정도로 설정해주는 것이 좋다. 이는 서로 상보적인 결합을 보다 잘 할 수 있게 하여 fusion에 사용하는 enzyme이 보다 잘 인지하도록 하는 것이다. 그렇게 되면 겹치는 서열들을 잘라주고 붙여서 다시 vector 형태로 만들어주게 된다.

 

이런 식으로 서로 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 도입해주면 한쪽은 제거되고 insert가 vector로 들어가게 된다.

 

 

3) Plasmid에 mutation 주기

 

우리가 어떤 단백질들의 기능을 볼 때 단백질의 특정 기능만 빼고 싶을 때가 있다. 얘를 들면 인산화 기능을 없애고 싶을 때 다른 아미노산으로 바꿔주어야 하는 경우들이 있다. 따라서 Threonine이나 Serine을 Alanine으로 치환해주게 되는데 이때 point mutation을 진행한다. 얘를 들어서 AIMP2 T82A를 만들 때 ACA를 GCA로 바꿔주는 것이다. 혹은 해당 아미노산을 삭제하고 싶을 때도 있을 것이다. 그때는 해당 sequence를 건너뛰는 과정이 필요하다. 아니면 또 다른 아미노산을 넣어주고 싶을 때도 있을 것이다. 이럴 때는 이미 갖고 있는 plasmid vector가 있다면 간단하게 변형을 줄 수 있다.

 

원하는 서열을 넣은 상태로 primer를 설계 후 PCR을 진행한다. 이때 primer 디자인 방법은 다음과 같다.

 

 

각 방법에 따라 primer를 설계하는 방법 예시

 

① insertion

기존 insert에 내가 원하는 서열을 넣어 주기 위해서는 기존 서열을 물고 다른 FWD 혹은 REV쪽에 넣거나 서열을 나누어 넣어줘도 괜찮다.

② deletion

기존 Insert에 내가 원하는 서열을 제거하기 위해서는 기존 서열을 물고 가다가 빼고 싶은 서열은 제거하여 primer를 설계한다.

③ point mutation

기존 Insert에 내가 원하는 서열에 대해 point mutation을 주기 위해서는 기존 서열을 물고 가다가 원하는 mutation을 넣어준다.

위 3가지 primer들의 공통점은 linear하게 vector를 만드는 것이다. 이후 T4 ligase를 이용하여 blunt end를 이어주는 것이다. Fusion 방법과 헷갈리지 않게 조심하자!

 

이렇게 짜면 blunt end가 만들어지는데, gel extraction을 진행하여 Dpn I이라는 restriction enzyme을 사용한다. 이는 GATC의 A가 methylation된 것을 인지하여 자르는 효소로, E. coli에서 plasmid를 methylation하는 특징을 이용한 것이다. 해당 방법을 통해 조금이라도 남아있을 기존 plasmid를 제거하여 원하지 않는 기존의 wild type vector가 transformation 되어 comp. cell로 들어가는 것을 방지한다. 반면 PCR로 증폭된 서열은 methylation이 일어나지 않았기에 그대로 남아있다. 이후 T4 ligase와 같은 ligase를 활용하여 ligation을 진행한다. 이렇게 plasmid vector를 생성하고 transformation을 진행한다. 그리고 colony가 형성되었을 때는 최소 3개에서 많게는 7개 정도의 colony에 대해 small culture 후 sequencing을 의뢰하여 내가 원하는 mutation이 제일 잘 들어간 것을 선정하여 large culture를 진행한다(물론 colony PCR을 통해서도 가능하다).

요즘은 이러한 기존 vector 제거 system이 탑재된 kit들이 많이 나오고 있다. Ligation과 enzyme restriction 과정이 모두 한 번에 일어나는 것이 있기에 보다 효율적으로 mutation을 진행할 수 있다.

 

 

 

 

 

이론은 빠싹한데... 왜 안 나올까... 내 시간....ㅠ 

너무 슬프다...

언제 또 될까...ㅠ