Cell Culture

*세포를 잘 키우려면 일단 아침 저녁으로 확인 후 이상이 있다면 그 즉시 대처하는 것에서부터 시작해야 한다.
*매일마다 media를 교체해주는 것이 마냥 좋지만은 않다. 세포들이 자라면서 분비하는 signaling molecules(cytokine, chemokine)이 세포들이 자라는데 필요하기 때문이다. 따라서 media의 색이 변해간다 싶을 때 교체해주는 것이 좋다(media에는 phenol계 지시약들이 들어 있다. 그래서 불그스름한 색을 띈다. 또 앞서 언급한 것처럼 media에 다양한 단백질들이 섞이게 된다. Media 자체의 단백질과 FBS에 들어있던 것 등 외부 물질이 섞일 수도 있다. 그렇기에 PCR 시 높은 purity를 위해서, Westerblot 시 보다 깔끔한 band를 위해서 sample을 harvest 할 때 꼭 1X PBS로 wash 후 시작하는 것이 좋다. 얼릴 때도 꼭 wash를 먼저 하고 얼리자! 얼었다 녹은 상태에서 wash를 진행하면 세포들의 loss가 있을 수도 있다.)
★100Φ기준★
1. 현미경으로 세포를 우선 관찰한 후 confluency가 90%가 되면 subculture를 진행한다.
2. 먼저 plate에 들어있는 media를 suction 후 1X PBS로 wash를 진행한다. 1X PBS는 벽면에 3ml를 pipette aid로 쏘아준다. Plate 전반에 걸쳐서 돌려준다. 이를 진행하고 나면 불그스름하게 PBS가 바뀌어 있을 것이다.
3. 이후 nX T/E를 1ml 벽면에 micropipette/pipette aid로 분사 후 plate 전체에 둘러준다. 이때 cell이 떨어져 나가지 않게 조심한다. 이후 10~30초 정도 제자리에서 incubation 후 suction기로 T/E를 제거한다. 이때 가 쪽에도 있을 T/E를 깔끔하게 제거해준다. 그러고 나서 제자리에서 다시 20초 정도 기다려준다.
*T/E의 n은  lab마다 또 lab 내 사람마다 그리고 사용하는 세포마다 다 다르다.... 경험에 따라서 사용하길
4. Plate에 물리적인 충격(두드리기)을 가해서 세포들을 떼어낸다. 떨어져 나간 세포들은 plate 바닥을 타로 흘러내릴 것이다. 이러한 것이 관찰되면 complete media(10%FBS, 1%P/S가 들어간 RPMI, DMEM, MEM 등등등)를 pipette aid를 활용하여 plate 바닥에 쏴 준다. 이때 쏴 주는 양은 subculture하는 비율에 따라 달라질 것이다(이 subculture 비율은 ATCC에 들어가면 친절히 안내되어 있다). 100Φ 하나 당 3ml로 생각하면 된다. 이후 pipetting을 진행하여 cell이 뭉친 것을 풀어준다.
5. 옮길 plate에는 complete media 6ml를 미리 깔아 놓고 거기에 세포가 들어있는 complete media를 3ml씩 넣어주고 좌우 상하로 잘 흔들어 준다. 이때 plate를 돌리면 안된다. 이렇게 되면 cell이 뭉치게 된다고 한다.
6. 이렇게 잘 culture한 plate는 상단 네모 칸에 cell 이름을 써주고 이후 원하는 곳에다 media 종류 및 날짜, 본인 이름(꼭 쓰자!!! 안 그러면 헷갈릴 수도 있음)을 label 후 애지중지 다루며 cell incubator로 옮겨주면 된다.
*cell이 너무 자라게 되면 얼려주고 또 stock이 너무 많다면 그냥 culture 때 cell이 든 media를 모두 다 subculture 하지 말고 일부는 버리고 남는 것으로 유지하면 된다.
*주 1회 centrifugation을 통한 debris 제거 작업이 필요하다. Cell이 든 media를 15ml 또는 50ml conical tube에 옮겨주고 이를 centrifuge 후 subculture 비율만큼 media를 넣어서 세포를 풀어준다.