Westernblot Protocol(Polyacrylamide Gel 만들기부터 SDS-PAGE, TRANSFER, DETECTION까지)

Westernblot

 

1. 샘플 개수에 맞춰 glass plate를 준비한다.

 

이때 long plate의 두께와 loading volume 등을 고려하여 comb을 준비해준다. 이는 사용하는 재료들의 제작 회사들에 따르니 insert를 보고 참고 하시길..

 

2. n% seperating gel mixture를 만들어서 7.5mL를 glass plate 안에 넣어준다.

 

나는 보통 1개면 10mL, 2개면 20mL, 3개면 25mL, 4개면 35mL 만들어준다. 그냥 여러 개 만들었을 때 최대한 아낄 수 있고 모자라지 않을 정도로 만들어준다.

그리고 TEMED를 넣어주는데 이는 촉매 역할을 하는 물질로, 너무 많이 넣어주면 굳는 속도가 빨라져서 좋지 않다. 이는 gel이 전체적으로 굳는 속도가 달라져서 밀도가 달라지는 큰 일이 생길 수도 있으니 주의할 것… 그럼 밴드가 금문교처럼 나올 수도 있다.

 

3. Isopropanol을 각 plate에 500μL씩 넣어주고 상온에서 20~30분 정도 둬서 굳힌다.

 

밥 먹고 오면 gel 뚝딱!

 

4. Isopropanol을 버리고 tap water 혹은 D.W.로 씻어주고 plate를 최대한 기울여서 물을 제거해준다.

 

킴테크나 이런 거로 닦아줘도 괜찮고 suction으로(10p) 꽂아서 해줘도 괜찮다. Gel에는 최대한 닿지 않게 해서…

그리고 D.W.를 사용한다면 squeeze bottle을 사용하자. 깔끔하게 소량만 써서 한 3회 씻어주면 좋다.

이때 Isopropanol을 완전히 제거하지 않으면 stacking gel 상태가 메롱메롱해진다.

 

5. Stacking gel mixture를 만들어서 separating gel 위에 가득 채워주고(대략 2.5mL인데 개당 한 3mL로 생각하고 여분으로 조금 더 만들어주면 좋다) 조건에 맞는 comb을 꽂아주고 상온에서 10~15분가량 둬서 굳힌다.

 

간혹 가다 plate는 1.5mm인데 comb이 1mm인 것들이 있다…. 이러면 loading 할 sample 양도 달라지고, transfer할 때도 대각선으로 생겨서…. 일정하게 transfer가 일어나지 않는다…

 

6. 이후 sample이 준비가 되면, plate들을 cast에 넣고 1X SDS를 부어준 후 sample을 loading 한다.

 

이때 각 comb의 두께 및 comb 머리 개수에 따라 각 well에 loading 할 수 있는 양이 달라지니 제품에 따라 확인해보는 것이 좋다.

Loading tip이라는 것도 존재한다. 이는 tip 끝이 얇아서 loading 하는데 있어 최적화되어 있다.

 

7. loading이 끝났으면 tank에 lid를 씌우고 90V로 30분, 120V로 1시간 정도 running한다.

 

이때, 90V 30분은 stacking gel에서 sample들이 동일 선상에 놓이게 하는 과정으로 출발점을 똑같이 만들어주는 것이다.

*Stacking gel의 pH는 6.8이고, separating gel은 pH가 8.8이기에 각 gel에서 Chloride ion과 protein 그리고 Glycine 순서로 정렬된다. 즉, glycine이 제일 먼저 내려가고 그 다음 protein 그리고 chloride ion이 위에서 눌러주는 형태이다. 이로써 모든 protein들의 시작점을 동일하게 만들어준다.

 

8. 시간이 한 10분 정도 남았을 때 새로운 tank를 준비하고 1X transfer buffer를 부은 후 스티로폼 박스에 tank를 넣어두고 주변에 얼음이나 ice pack을 넣고 또 물을 채워준다.

Transfer도 다양한 방법들이 있으나 내가 쓰는 것은 wet transfer를 기준으로 한다. 정말 WET이다…ㄹㅇ 한강이 따로 없다.

그리고 나는 1X transfer buffer가 담긴 tank에도 작은 ice pack을 넣어준다.

Transfer 과정 자체가 발열이 심하기에 이는 transfer에도 좋지도 않다.

 

9. 알맞은 크기로 제단 된 PVDF membrane(나는 보통 6cm x 9cm로 잘라서 명함통에 모아뒀다)을 MeOH에 1분간 soaking 하여 activation 시킨다.

 

PVDF membrane은 몸에 좋지 않으니 membrane을 맨손으로 만지지 말고… 또 손에 묻은 단백질이 membrane에 묻을 수도 있으니 그냥 꼭 장갑을 끼자!

 

10. 이후 activated PVDF membrane과 3M PAPER를 1x transfer buffer가 담긴 tank에 넣어준다.

 

이때 transfer 할 때 사용하는 3M paper는 gel 한 개당 4장이다.

 

11. 이쯤 되면 running이 끝나 있는데 gel을 cast에서 꺼내 stacking gel을 잘라내고 1X transfer buffer를 소량 부은 통에 gel을 담궈 rocker에 올려서 5~10분간 incubation한다.

 

이때 gel이 많다면 gel 모서리 일부분을 살짝 잘라서 표시해도 괜찮다. PVDF membrane도 이에 맞추어 해준다.

 

12. Cassette의 투명한 판이 아래에 오도록 펼친 후 sponge를 투명판, 검정판 위에 각각 한 장씩 얹고 3M paper 2장 겹친 것을 또 그 위에 각각에 얹어준다(이렇게 gel 1개 당 총 4장이 필요한 것이다). 이후 투명한 판 위에 있는 3M Paper 위에 PVDF membrane을 기포가 생기지 않게 조심스레 올려주고 이 위에 separating gel을 또 얹어준다.

 

이때 gel을 얹을 때 PVDF membrane과 gel 사이에 기포가 생기지 않도록 조심스레 올려준다.

 

13. gel까지 다 얹었으면 다른 3M PAPER 2장 겹친 것을 gel 위에 올려주고 그 위에 sponge를 얹어준다. 그러고 나서 roller로 살짝 눌러준다. 한 번이면 충분하다.

 

Roller로 밀어서 사이에 혹시 모를 기포를 제거해주는 것인데, 이때 너무 세게 하거나 여러 번 하면 오히려 gel이 움직이거나 늘어나서 band가 이상하게 나올 수도 있다.

 

14. Transfer 용 electrode에 cassette을 색깔에 맞게 꽂아주고 membrane이 전체적으로 잠길만큼 1X transfer buffer를 넣어준다. 이후 35W로 1시간 30분에서 40분정도 transfer 해준다.

 

Transfer 조건은 자신이 보고자 하는 단백질에 따라 조건이 달라질 수도 있는데 protein size가 큰 것을 봐야한다면 35W를 45W로 한다거나 아니면 시간을 2시간에서 2시간 30분 정도로 늘려줄 수도 있을 것이다. 하지만 이는 조건을 잡아야 하기에 자신이 해보며 조건을 잡는 것이 좋을 것 같다. 내가 쓰는 조건은 그냥 웬만해서는 다 잘 나오더라…

 

15. Transfer가 끝나면 PVDF membrane을 보고 ladder가 잘 넘어갔는지 확인해주고(ladder가 잘 안 넘어가면 슬프다…. 단백질이 다 안 넘어갔을 수도 있기 때문이다) 해당 PVDF membrane을 1X TBST(Tween 0.05%)로 washing 해주고(명함통에 담궈서 한 두어번 정도….) skim milk가 들어있는 blocking buffer(1X TBST 10mL에 약숟가락으로 skim milk 한 스푼 정도…?) 로 30분간 blocking 한다.

 

이때 skim milk는 그냥 시중에 파는 거 써도 무관하다. 굳이 바이오 용 안 사도 괜찮다! 괜히 가격에 바이오 프리미엄 붙는 게 아니더라….별반 차이도 없는데....

 

16. blocking이 끝나면 1X TBST로 washing을 열심히 해서 우유 색이 안 나오게 한 후 diluted 1st antibody를 부어주어 shaker에서 상온 2시간 incubation 혹은 rocker에서 4℃ overnight incubation 진행한다.

 

1st antibody는 사용하는 제품에 따라 dilution 비율도 달라지고 조건도 달라진다. 나 같은 경우는 sodium azide 0.02%인 1X TBS(여기는 tween 안 넣었다!)에 항체 10μL를 넣어준다.

불타면 짧게 찍으면 되지 뭐….

 

17. 1st antibody incubation이 끝나면 washing을 1X TBST로 한 번 해주고 이후 1차 항체가 mouse인지 rabbit인지 보고 이에 맞게 2차 항체를 dilution하여 membrane에 부어주고, shaker에서 상온 1시간 정도 incubation 한다.

 

이때 dilution할 때 skim milk를 적당량 넣어준다. 예를 들면 약숟가락 뒤에 있는 거 한 스푼 정도…?

 

18. 2nd antibody incubation이 끝났으면 1X TBST로 washing을 3회가량 해주고 마지막 washing 때는 버리지 않고 그 상태 그대로 shaker에서 상온 15분 incubation 한다. 이후 마지막 washing이 끝나면 기존에 담겨 있던 1X TBST를 버려주고, 다시 한 번 washing하고 버린 후, 1x TBST에 담아둔다.

 

19. 이제 본인이 사용하는 ECL 종류에 따라 detection을 해준다.

 

ECL도 감도에 따라 dilution 조건이 달라지는데 이때 마냥 농도를 높인다고 좋지만은 않으니… DW랑도 적당량 섞어줘라!

 

20. 제일 중요한 거! 잘 나온 결과를 보고 기뻐한다.....

 

제일 어렵다 이게