Co-IP(immunoprecipitation)
Co-IP의 목적
Co-IP는 분자생물학적으로 단백질들 간의 상호작용을 보기 위해서 진행하는 실험 기법으로, 어떤 단백질 A가 있을 때 해당 단백질과 붙어 있는 다른 단백질에는 어떤 것들이 있는지 확인하기 위함이다. 즉, 단백질 A에 대해서 항체를 이용해 pulling 하게 되면 상호작용을 하고 있는 다른 단백질들이 같이 끌려나오게 된다. 이를 통해서 단백질들 간의 상호작용을 확인할 수 있으며, binding 세기를 상대적으로 비교할 수 있다.
과정은 다음과 같다.
1. Harvest
1) Westernblot 시 RIPA 및 detergent가 함유된 lysis buffer는 사용 금지(안에 들어 있는 SDS가 protein 간의 interaction을 끊을 수도 있기 때문). NP-40나 Triton X 와 같은 buffer를 사용하는 것이 좋음.
2) IgG 확인용이 필요하기에 샘플 전체에서 일부 떼어온 것과 IgG의 양이 동일하도록 해준다. 예를 들면, 6 well에서 sample이 5개 있다면 각 well을 240μL씩으로 녹인다면 240-x=5x, 240=6x, x=40이 되도록 옮겨 담아준다.
2. Sample 나누기
1) Sample의 일부는 새로운 Ep-tube 1개로 각 옮겨준다.
① 하나는 whole cell lysate로 사용할 예정. 10%정도만 옮겨준다. 해당 샘플은 sample buffer를 넣어서 바로 끓여주자.
② 다른 하나는 IgG를 이용하여 noise를 잡을 용도. 항체의 Fc region에 비특이적으로 결합하는지를 확인하기 위함임.
ㄱ. IgG는 IP용 sample과 동량이 되도록 준비하는데 이때 IgG는 IP할 항체의 종류(mouse, rabbit)에 맞춰서 진행함.
ㄴ. IgG는 단백질 500μg당 1μL를 사용함.
ㄷ. 이때 IgG sample의 양이 적을 경우 lysis buffer 또는 cold PBS를 넣어서 다른 sample들과 양을 맞춰준다.
2) whole cell lysate와 IgG sample에 원하는 항체를 각각 넣어주고 4℃ rotator에서 2시간 넣어준다. 이때 항체 농도는 단백질 500μg당 1μL를 사용함.
① sample 160μL 1개당 항체를 넣어주는데 이때 cell signaling은 1μL면 충분하지만 Santa Cruz의 경우 2~3μL를 넣어준다고 한다.
② 이때 sample의 양이 너무 적으면 rotator에서 섞이지 않아서 lysis buffer를 조금 추가해주어 잘 흔들리게 하는 것이 좋다. 1ml가 될만큼!
3. Bead
1) Rotator에서 2시간 incubation 시, bead를 준비한다. 이때 bead는 FITC Ab box에 있음. Santa Cruz A/G Plus Bead가 있는데 이거는 rabbit과 mouse 둘 다 잡을 수 있음. A는 rabbit 잡과 G는 mouse 잡음
① bead 원 vial은 inverting으로 섞어준다. 이는 bead가 바닥에 가라 앉아 있기 때문이고 또 voltexing으로 섞으면 bead가 깨지기 때문임.
② 200p tip 끝을 자른 후 sample 1개당 40μL씩 넣어 줌. 이때 bead는 쓸 만큼만 덜어서 사용한다.
<Optional: bead가 alcohol에 들어있는 제품이면 washing 과정이 필요함>
ㄱ. 만약 sample이 5개가 있으면 1.1배로 220μL를 덜어내고, 여기에 cold PBS를 1mL씩 넣고 table top centrifuge로 200~300g로 1분간 spin down 후 sup을 따는 과정을 3번 반복한다.
ㄴ. 이후 sample 당 100μL만큼 bead 용액을 넣어줘야 하기에 5개의 경우 cold PBS를 550μL만큼 넣어준다. Suspension 시킨 후 100μL씩 sample이 든 vial에 넣어준다.
이후 rotator에서 1시간가량 incubation 시킨다.
③ incubation 후 200-300g에서 1분간 centrifugation하고 sup을 10p와 200p를 합쳐서 끼운pipette으로 따준다. 이때 bead가 마르지 않게 살짝 남겨둔다.
④ washing buffer(1X cold PBS or lysis buffer(e.g. NP-40, Triton X 등), 근데 PBS를 더 많이 씀) 700μL를 넣어주고 inverting을 통해 suspension 시킨 후 200-300g로 quick spin 후 멈춘다. 해당 과정을 3회 진행한다.
4. Westernblot 준비
1) washing 후 sup.을 제거한 뒤 1.5-2X sample buffer 35~50μL를 넣어주고 voltexing 후 10분간 95℃에 끓여준다.
2) 다 끓인 후 bead가 들어있는 sample을 centrifugation을 통해서 짧게 200-300g에 도달하면 멈춰주고 이후 sup을 따서 전량 loading 한다.
Tips.
Westernblot 시, 항체가 지저분하게 찍히는 것들이 있다. 또 불타게 찍히는 것들도 있다. 이런 sample들이 있다면, 60Φ로 실험을 진행하여 harvest 양을 늘리고, 이를 나누어 gel에 loading하는 것도 좋은 방법이 될 것이다.