Fluorescence Spectroscopy
Fluorescence Spectroscopy: 특이성은 낮지만 활용도가 높은 방법!
1. 원리
1)원리
①물질은 빛을 흡수하여 들뜬 상태가 된 후 과잉의 에너지를 외부로 방출→다시 바닥상태로 돌아옴!
② 두 가지 방법에 의하여 에너지를 방출(relaxation; 완화)
ㄱ. 주변에 열로 방출하는 방법~>대부분의 물질
ㄴ. 빛 에너지로 방출하는 방법: 일부 화합물의 경우 이와 같은 발광(luminescence)현상을 나타냄
ㄷ. 형광(fluorescence), 인광(phosphorescence) a및 화학발광(chemiluminescence) 등으로 나눔
③양상
ㄱ. 에너지를 흡수하고 이후 방출함!
ㄴ. 이때 방출된 에너지가 빛 에너지 형태로 일부 방출되는데 이러한 형광을 관측하는 것!
④ 흡수했던 에너지보다 파장이 조금 길게 나옴! 에너지 준위가 일부 낮아지고 ground state으로 돌아오기 때문에!
⑤형광: 바닥상태에 있는 일중항(singlet) 전자스핀을 가지는 전자가 빛을 흡수하여 들뜨게 되면 들뜬 일중항(excited singlet) 상태의 여러 에너지 준위로 전이한 후 들뜬 상태의 최저 에너지 준위로 전이하여 약간의 에너지를 방출한 다음 다시 빛을 방출하면서 스핀 변화가 없이 바닥 일중항(ground singlet) 상태로 돌아오게 되는데 이와 같은 발광을 말함.
⑥인광(phosphorescence): 에너지 준위 차이가 별로 없는 들뜬 삼중항(triplet) 전자 스핀 상태가 있으면 계간전이(intersystem crossing)에 의하여 삼중항 전자 스핀 상태로 전이한 후에 바닥 일중항 상태로 되돌아오면서 발광함
ㄱ. 이러한 인광은 생물체에서 많이 찾아볼 수 있음
ㄴ. 일반적으로 형광은 10-4~10-8초 정도로 매우 짧은 시간에 발생하지만 인광은 10-4~102초 정도로 형광에 비해 반감기가 매우 길다!
⑦ 화학발광: 화학반응으로 생성된 들뜬 상태의 화학종이 바닥상태로 되돌아오면서 발광이 나타나는데 이를 화학발광이라고 함
2) 활용
① 형광분석법: 여러 중요한 극미량 무기 및 유기 화학종을 정량하는데 용이하며 특히 인광이나 화학발광에 비하여 응용되는 정도가 높음
② 장단점
ㄱ. 장점:
a. 흡광도법보다 상당히 넓은 농도에서 linearity를 나타냄
b. 특정 물질만 형광을 내므로 높은 선택성을 가짐!
c. 적은 양만 있어도 검출이 가능함!
ㄴ. 단점
a. 감도가 매우 좋기 때문에 정량분석 시 시료 매트릭스로부터 심각한 방해를 받음
b. 정량분석 응용에서는 발광법보다 흡수법을 주로 사용하는데 자외/가시선을 방출하는 화학종보다 흡수하는 화학종이 더 많기 때문
3) 에너지 변화
① energy loss: due to molecular vibration in between the absorbance and emission processes, the fluorescence is usually lower energy(higher wave length) than the absorbance
② 전자가 excited 후 spontaneous decay to a meta-stable state로 전이한다. 이후 빛이 방출되는데 이가 형광이 됨!
③어디까지 가서 어디까지 내려오는지가 형광 빛의 색을 결정하는데 중요한 요소가 된다.
④ 형광 스펙트럼
ㄱ. 들뜸 스펙트럼(excitation) 스펙트럼: 시료로 들어가는 빛인 들뜸파장을 변화시키면서 일정 파장에서 광발광 세기를 측정한 것으로 기본적으로 똑 같은 조건에서 얻은 UV-vis 흡수 스펙트럼과 같은 형태의 스펙트럼이 얻어짐
ㄴ. 방출 스펙트럼(emission): 들뜸 파장을 고정시키고 시료에서 나오는 빛인 방출되는 빛을 파장을 변화시키면서 방출 세기를 측정한 것으로 광발광 파장이 들뜸파장보다 길고, 인광 파장이 형광 파장보다 김.
ㄷ. 들뜸 스펙트럼은 UV-vis 흡광 스펙트럼과 유사하며 방출 스펙트럼은 들뜸 스펙트럼과 선대칭의 관계를 가지며 형광 방출은 흡광보다 장파장 쪽에서 나타남.
2. 형광광도계: 주로 Xe을 사용함
1) 형광광도계
① 주로 Xe-arc 램프가 사용됨.
3. 형광 양자수율과 형광세기
1) 형광 양자수율과 형광세기
① 형광 또는 인광의 양자수득률(quantum yield) 또는 양자효율(efficiency)은 발광 분자수 대 들뜬 분자수의 전체 수의 비를 나타내며 물질에 따라 고유의 값을 나타냄
ㄱ. 형광 세기와 형광물질의 농도와의 관계를 Lambert-Beer의 법칙으로부터 유도 가능!
ㄴ. 형광물질의 농도를 c,, 입사광의 세기 PO, 일 때 투과광의 세기는 이 둘에 비례함!
② Brightness and Quantum Yield
ㄱ. fluorophores:
a. 같은 빛을 받아도 fluorophore에 따라 다르다! Can be defined as the intensity ratio of emitted to absorbed light
b. 같은 물질이라 하더라도 용매에 따라서 형광이 달라질 수도 있음
ㄴ. Quantum yield: 흡수한 photon과 방출한 photon의 비율! → temperature와 pH에 따라 달라짐!
ㄷ. 만약 A가 0.05보다 작을 때 형광의 세기는 농도에 비례한다.
ㄹ. 낮은 농도에서는 정량이 가능하다!
4. 형광의 전이형태와 분자구조
1) 전자전이
① 형광은 250nm 이하의 자외선을 흡수하였을 때 거의 발생하지 않는데 이는 에너지가 너무 커서 유발분해 또는 분해가 일어나기 때문
ㄱ. 따라서 σ→ σ*전이에 의한 형광은 거의 나타나지 않음.
ㄴ. 대신 에너지가 적은 π→ π* 및 n→π* 과정에 의해 형광이 발생함
ㄷ. 대부분 형광 화합물의 경우 n→π* 또는 π→ π*로의 전이로 형광이 발생되며 두 전이 중 에너지가 작은 것이 형광을 발함.
a. 가장 작은 에너지 전이가 n→π*형보다 π→π*형인 화합물에서 형광을 더 잘 발하는데 이는 양자효율이 π→π*전이가 더 크기 때문!
b. 화합물로 분자구조가 단단한 판상화합물일수록, 방향족 환의 수가 증가할수록 형광 강도가 강해짐!! Conjugation이 일어나기 좋은 환경이 되니깐!!!
2) Fluorophore
① fluorophore is fluorochrome(or fluorescent chromophore) covalently bonded to a macromolecule and used to statin tissues, cells, or materials for fluorescent imaging and spectroscopy→macromolecule에 공유결합으로 붙임!!!
ㄱ. UV-vis를 흡수하고 vis-IR을 방출함!
ㄴ. biochemistry and protein 연구에서 많이 사용됨! e.g. immunofluorescence and immunohistochemistry→ELISA 같은 거, GFP 등등
ㄷ. indirect immunohistochemistry: 형광을 내는 물질을 바로 붙이는 것이 아니라 형광 물질을 잡을 수 있는 antibody를 먼저 뿌리고 그 다음에 그 antibody에 붙는 형광 물질을 붙임!
→형광물질들을 공유할 수 있음!!!
② 붙는 작용기
ㄱ. amino group, carboxyl groups, thiol, azide에는 공유결합으로
ㄴ. non-specifically(glutaraldehyde)
ㄷ. non-covalently: via hydrophobicity
3) Stokes shift
① 정의: the stokes shift is the gap between the maximum of the first absorption band and the maximum of the fluorescence spectrum
ㄱ. excited state에서 충돌로 인해 vibrational energy에 의한 열전환이 생긴다.
ㄴ. 간단히 말하면 excitation 때의 에너지와 emission 때의 에너지 차이다. →λmax와의 차이
4) Fluorescence Probes
① ROS probes인 hydrocyanines을 활용
ㄱ. 자체로는 형광이 없으나 ROS와 반응시 fluorescent cyanine으로 변하게 됨!
ㄴ. 이렇게 반응을 하고 나면 형광을 갖게 되는 것임.
② DNA나 특정 물질들에 가서 붙으면 형광을 띄게 하는 시료들이 있음!
5) Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)
① 방출된 빛 에너지가 다른 어떤 물질에 의해서 흡수되는 현상!
ㄱ. non-radiative transfer of excited-state energy from a donor molecule to acceptor molecule
→일종의 quenching임
ㄴ. Donor and acceptor molecule이 가까이 있어야 함! 10nm 이내에!!!
ㄷ. 이런 식으로 donor의 방출되는 형광과 acceptor의 흡수되는 영역이 겹치면 FRET이 일어나게 된다!
ㄹ. 이때 보다 장파장이 방출되게 된다.
② 활용
ㄱ. 분자운동을 공부하는데 있어서 유용하게 사용된다.
→as FRET is very sensitive to the distance between donor and acceptor.
ㄴ. biophysics and biochem.에서 protein-protein interactions, protein-DNA interactions and protein conformational changes를 보는데 유용하게 쓸 수 있다.
ㄷ. 이러한 분야들에서 3차원 영상을 만드는데도 사용할 수 있다!
ㄹ. biological use: cyan fluorescent
a. CFP의 emission이 YFP의 absorption과 겹친다!
∴ transfer가 일어나게 됨!
b. actin의 연결 여부를 이를 통해 확인할 수 있음!
c. FRET between two protein interacting protein, labelled with fluorescein and tetramethylrhodamine.
5. 형광에 영향을 주는 인자
1) 소광(Quenching): 형광 분석 시 형광의 세기가 줄어드는 현상
① 소광의 원인
ㄱ. 온도&용매
a. 형광의 양자 효율은 온도가 증가함에 따라 감소. 이는 분자간의 충돌 횟수 증가에 의해 빛의 발생이 없는 형태의 전자전이 즉 외부 전환의 가능성이 증가하기 때문
b. 용매의 점도가 감소함에 따라 용매 분자간의 충돌 횟수가 증가하여 외부 전환 가능성 증가로 온도와 마찬가지 효과를 가져올 수 있음.
c. 용매의 극성에 따라서도… 극성이 높을수록 긴 파장, 극성이 낮을수록 짧은 파장!
*온도가 낮아지면 충돌도 적게! →극성이 낮아지는 것과 유사한 효과를 줌! 이는 solvent motion이 감소하기 때문이다.
ㄴ. pH
a. 산성 또는 염기성 고리치환체를 갖는 방향족 화합물의 형광은 보통 pH에 의해 영향을 받으며, 형광 파장과 세기는 이온화된 형태와 이온화 되지 않은 형태에 따라 다름
∴ 형광법으로 분석하려고 할 때 pH를 매우 정확하게 조절해야 함.
ㄷ. 농도 영향
a. 시료 용액의 농도가 너무 높을 경우로 이를 농도 소광이라고 함.
b. 자가소광(self-quenching): 들뜬 상태의 분자들 간의 충돌에 의한 것으로 농도가 증가할수록 증가함→ 이는 충돌할 기회가 더 많아지기 때문
c. 자기흡수(self-absorption): 흡수봉우리와 형광방출파장이 겹칠 때 다른 형광 분자에 의해 다시 흡수되면서 나타남
ㄹ. 용존산소의 영향
ㅁ. 상자성 이온의 영향: 상자성(paramagnetism)이온과의 상호작용으로 인한 계간전이가 증가하여 삼중항 전자스핀 상태로의 변화되는 현상
ㅂ. 그외…
a. 녹인 물질에 따라 방출하는 파장이 달라짐→solvent contains heavy atoms will decrease fluorescence but increase phosphorescence
② 소광으로 인해 나타나는 양상
ㄱ. quenching: 원래 기존의 형광보다 intensity가 낮아지는 모든 현상
ㄴ. 종류: excited state reactions, energy transfer, complex formation, and collisional quenching
→heavily dependent on pressure and temperature
ㄷ. quenching에 영향을 주는 화학종들: oxygen iodide ion 그리고 acrylamide 등이 있음
2) Effect of Concentration on Fluorescence
① 낮은 농도에서는 양자수율이 높아서 self-quenching이나 self-absorption이 없음. 따라서 linearity가 好
② 고농도에서는 양자수율이 낮아서 self-quenching이나 self-absorption이 일어남. 따라서 고농도에서는 linearity가 보이지 않음.
③ Self absorption: 방출한 빛을 흡수함
3) pH Effects
① pH에 따라서 AU가 달라진다!
② fluorescence is pH-dependent for compounds with acidic/basic substituents
③ pH가 높아짐에 따라 흡광도가 서서히 낮아짐…
4) Effect of Dissolved O2
① increase[O2] →fluorescence 감소=용존산소량이 증가하면 형광이 감소한다!
ㄱ. oxidized fluorescing species
ㄴ. paramagnetic property increase intersystem crossing(spin flipping)
6. Applications: 세포생물학, 생화학 등등에서 주로 많이 사용함.
1) Determination of nitrogen monoxide
① NO는 체내에서 혈압을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 물질이다.
② NO의 양을 측정하는데 있어서 형광물질을 사용한다.
③ DAF-FM이 NO와 붙었을 때 형광을 내는 형태로 변한다! →ring을 형성하기에!
*이러한 형태로 여러 바이오센서로 활용한다.
2) Biological systems
① light emission을 활용한다! 특히 luminescence → light emission as a result of a chemical reaction without the production of heat or any thermal changes
② luminescence의 종류
ㄱ. bioluminescence: light emitted from a biological source
ㄴ. chemiluminescence: light emitted from a non-biological source due to a chemical reaction
a. luminol(used to detect blood)
b. phenyl oxalate ester(glow stick)
ㄷ. bioluminescence vs. fluorescence
a. bioluminescence: luciferase enzyme을 이용하여 반딧불이가 D-Luciferin을 oxyluciferin을 만들 때 에너지를 방출하는데 이때 빛 에너지로 방출된다. 이러한 형태를 bioluminescence라고 함.
b. fluorescence: 어떤 물질 그 자체로 에너지를 흡수해서 빛을 방출함! → 형광을 방출한다.
c. 활용: promoter가 잘 작동하는지 보려고 특정 gene에 luciferase를 만드는 gene을 삽입함. 이후 그 특정 gene이 발현이 되려면 luciferase도 같이 발현이 되어야 하기 때문에 bioluminescence가 관측되는지 봐야함!
→식물에게도 luciferase gene을 삽입하면 자체발광을 하게 됨!
ㄹ. Bioluminescence in Nature: bacteria나 dinoflagellates(미세조류), 그리고 물고기나 곤충들에게서 발견된다!
3) Observation of multiple activities
① 사람의 염색체를 확인하는데 사용하기도 함
② 감염증
ㄱ. 빨간색: mycobacteria
ㄴ. 초록색: neutrophils
ㄷ. 주황색: macrophages
③ Observation of cytoskeleton
ㄱ. cytoskeleton: 일종의 protein들로 구성됨.
ㄴ. actin filament는 빨간색, microtubule은 초록색, 핵은 파란색으로 나타남!
